施一公教授研究组在《科学》发表两篇论文
报道剪接体的三维结构并阐述RNA剪接的分子结构基础
清华新闻网8月23日电 8月21日，清华大学生命科学学院施一公教授研究组在《科学》（Science）同时在线发表了两篇背靠背研究长文，题目分别为“3.6埃的酵母剪接体结构”（Structure of a Yeast Spliceosome at 3.6 Angstrom Resolution）和“前体信使RNA剪接的结构基础”（Structural Basis of Pre-mRNA Splicing）。第一篇文章报道了通过单颗粒冷冻电子显微技术（冷冻电镜）解析的酵母剪接体近原子分辨率的三维结构，第二篇文章在此结构的基础上进行了详细分析，阐述了剪接体对前体信使RNA执行剪接的基本工作机理。这在世界上首次捕获了真核细胞剪接体复合物的高分辨率空间三维结构，阐述了剪接体对前体信使RNA执行剪接的基本工作机理。该成果的完成不仅初步解答了基础生命科学领域长期以来一直备受关注的核心问题，也为进一步揭示与剪接体相关疾病的发病机理提供了坚实的基础。清华大学生命学院博士后闫创业、医学院博士研究生杭婧和万蕊雪为两篇文章的共同第一作者。施一公院士为两篇文章的通讯作者。
基因剪接的分子机制示意图。
细胞是生物体的基本组成单位；而基因表达是所有细胞最基础也是最核心的生命活动。在所有真核细胞中，基因表达分为三步进行，分别由RNA聚合酶 (RNA polymerase)、剪接体(Spliceosome)、和核糖体 (Ribosome)执行。第一步简称转录（transcription），即储存在遗传物质DNA序列中的遗传信息通过RNA聚合酶的作用转变成前体信使RNA（pre-mRNA）；第二步简称剪接（splicing），即由多个内含子和外显子间隔形成的前体信使RNA通过剪接体的作用去除内含子、连接外显子，转变为成熟的信使RNA；第三步简称翻译（translation），即成熟的信使RNA通过核糖体的作用转变成蛋白质，从而行使生命活动的各种功能。描述这一过程的规律被称为分子生物学的中心法则，多个诺贝尔奖围绕此发现和阐述产生。其中，RNA聚合酶的结构解析获得2006年的诺贝尔化学奖，而核糖体的结构解析获得2009年的诺贝尔化学奖。
剪接体复合物的三维结构。
剪接体是一个巨大而又复杂的动态分子机器，其结构解析的难度被普遍认为高于RNA聚合酶和核糖体；虽然经过了过去二十多年的不懈努力，全球的科学家们还没有得到一个原子分辨率的剪接体结构。剪接体由五个小核核糖核蛋白（snRNP）、十九号复合物（Nineteen Complex，简称NTC）、十九号复合物相关蛋白（NTC Related）和一系列的辅助蛋白所构成,共涉及到100多个蛋白质和至少五条RNA分子。在剪接的过程中，剪接体以前体信使RNA分子为中心，按照高度精确的顺序进行逐步组装并发生大规模结构重组，使之得以完成复杂的剪接任务。剪接是真核细胞进行正常生命活动不可或缺的核心环节，因此具有重大的生物学意义。
许多人类疾病都归咎于基因的错误剪接或是针对剪接体的调控错误。人类35%的遗传紊乱是由于基因突变导致单个基因的可变剪接引起的：比如，单个剪接位点的增加或缺失可能引起α-或β-地中海贫血症；可变剪接平衡紊乱导致的某些外显子不正常表达可能导致额颞骨痴呆症。一些癌症也与剪接因子的错误调控有关。长久以来，剪接体的结构解析一直被认为是最值得期待的结构生物学研究之一。
施一公教授领导的课题组从2009年开始进入剪接体研究的核心领域，致力于剪接体及其相关复合物的结构生物学研究，并在2014年初首次报道了剪接体复合物中重要蛋白质Lsm蛋白七聚体以及其RNA结合状态下的晶体结构，这一成果被《自然》杂志收录（原文链接：http://www.nature.com/nature/journal/v506/n7486/abs/nature12803.html）。之后，该课题组聚焦于极富挑战性的攻坚课题：完整剪接体的结构生物学研究。终于在今年五月份取得重大突破，捕获了真核细胞剪接体复合物的高分辨率空间三维结构。这一成果是生命科学领域的重大原创性突破，标志着人类对生命过程和本质的理解往前迈进了关键一步。
在第一篇论文中，施一公教授研究组在对传统的串联亲和层析法进行改良之后，成功提取了内源性表达的酵母剪接体复合物，利用先进的冷冻电镜图像处理和三维重构方法，获得了剪接体高分辨率的三维结构。在结构中可以看出，剪接体的外形轮廓十分不对称，各个蛋白相互缠绕，形成了分子量和体积巨大的复合物。第二篇论文对剪接体的RNA组分进行了细致的结构分析，搭建了前体信使RNA被剪切、连接的原子模型，阐述了剪接反应进行的分子机制。
这一研究成果具有极为重要的意义。自1993年RNA剪接的发现被授予诺贝尔生理及医学奖以来，科学家们一直在步履维艰地探索其中的分子奥秘，期待早日揭示这个复杂过程的分子机理。剪接体近原子分辨率结构的解析不仅初步解答了这一基础生命科学领域长期以来备受关注的核心问题，又为进一步揭示与剪接体相关疾病的发病机理提供了结构基础和理论指导。
此项研究工作得到国家自然科学基金和科技部重大研究计划的资助。数据收集、处理分别依托于清华大学冷冻电镜平台和高性能计算平台，样品的质谱鉴定与上海生化所黄超兰研究组合作完成。
附：《科学》杂志两篇论文链接：
http://m.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac7629
http://m.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac8159
施一公研究组 2015 年 8 月 21 日在《科学》在线发表的两篇论文对分子生物学领域有什么意义？
食品安全、结构生物学
Spliceosome（RNA 剪切体）的工作极有可能获得诺贝尔奖（注）。
生物学现在（甚至是一直以来）最重要的基础问题是什么？是中心法则。
千兆编码逐个字节跨越酸、碱、盐、酶而很少出错，最终转化为流水线上的各种机器（蛋白质），是如何做到的？我们体内的信息，是怎样从 DNA 传递到 RNA，再传递到蛋白质的？这个过程，就是中心法则。
第一步，DNA 长啥样？通过把 DNA 晶体进行 X 射线衍射（下图），衍射结果进行傅里叶逆变换等处理，得到 DNA 分子结构模型。这个就是著名的 DNA 分子双螺旋结构。这是 1962 年的诺贝尔生理学和医学奖 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962。另外。DNA 和 RNA 生物合成机理的阐明，获得了 1959 年的诺贝尔奖 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959。
第二步，DNA 在 RNA polymerase（RNA 聚合酶）的帮助下，转录为 pre-mRNA（前体 mRNA）（注意：这时还没有转化为可翻译的成熟 RNA）。Roger D. Kornberg 拿到了 RNA polymerase 的晶体结构，阐明了其工作机理，获得了 2006 年的诺贝尔化学奖 The Nobel Prize in Chemistry 2006。
反过来，逆转录酶（存在于 RNA 病毒中）可以以单链 RNA 为模板合成 DNA。这个发现获得了 1975 年的诺贝尔奖 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1975。
第三步，pre-mRNA 转化为成熟的 mRNA。
第四步，成熟的 mRNA 从细胞核游到细胞质，在 ribosome（核糖体）的作用下，翻译为蛋白质。ribosome 的发现得了 1974 年的诺贝尔奖 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1974。其结构获得了 2009 年的诺贝尔奖 The Nobel Prize in Chemistry 2009。
问题来了：第三步是咋回事？
真核细胞的基因序列中，包含了内含子（intron）与外显子（exon），两者交互穿插。其中内含子在基因转录成 mRNA 前体后会被 RNA 剪接体（spliceosome）移除，剩下的外显子才是能够存在于成熟 mRNA（之后再进一步转译成蛋白质）的片段（语出 Wikipedia）。
因此，即使是同一条基因，在 spliceosome 的作用下，也可能表达出两种（两个 isoforms）不同的蛋白质。所以，阐明 spliceosome 的作用机理，至关重要。
例如：丙酮酸激酶 M1 型和 M2 型本是同一条基因，在 alternative splicing（可变剪接）的作用下分别表达为两种不同的蛋白。其中 M1 型存在于肌肉细胞中，活性很正常很稳定；但 M2 型则存在于癌细胞中，易受调节而失活，从而造成细胞代谢紊乱 (Mazurek, S. 2011 Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 969-980，有争议)。
那么，spliceosome 到底是怎么作用的呢？科学家通过一系列的实验，得出结论：
图片出自 Cindy L. Will and Reinhard Lührmann, Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Jul; 3(7): a003707.
Spliceosome 是一种由 RNA 与蛋白质剪接体次单位所组成的超大型复合物。Spliceosome 由五个核内小分子核糖核蛋白（snRNP）以及其他非 snRNP 蛋白质所组成。这五个小型细胞核核糖核蛋白分别为 U1、U2、U4、U5 和 U6 snRNP，各自含有一条 snRNA。pre-mRNA 经过 spliceosome 一系列 snRNP 的组装、活化、剪切、拼合的过程，最终形成成熟的、可翻译的 mRNA。
以上过程都是由各种间接实验推测而得。科学家们等了几十年，都没有得到直接的图像证据（结构）。
这两篇文章，讲的就是 spliceosome 的第一张高清三维电镜结构图。
他用电镜看到了什么？
上图是作者用超低温电镜三位重构解出的酵母 spliceosome 结构图，解释了其作用机理：
- U5 snRNA 起到中心支架的作用；
- U6 和 U2 snRNAs 相互交缠，形成催化中心；
- spliceosome 其实本质上是一个由蛋白指引的核酶，控制关键 RNA 的距离和位置，从而控制这个 splicing 反应。
这个结构如此重要，为什么现在才解出来？
为什么是施一公组而不是别人解出了这个结构？
首先，这并不是这个结构第一次发表。之前英国剑桥 MRC 的 Kiyoshi Nagai 就通过结晶的方法，解出过这个大分子复合物一部分的结构，但没有这个结构完整。
第二，这个结构的解析非常非常难。Kiyoshi Nagai 就称其为“令人害怕地困难”。体系无比巨大（例如本文中的结构就含有来自 37 个蛋白 +4 个 RNA 大分子的 10,574 个氨基酸，加起来有一百多万道尔顿）；结构超级复杂，更有很多不稳定的区域。
这就使结晶整个大分子复合物，成为基本不可能的事情。幸而近几年 CryoEM（超低温电镜三位重构）技术有了突破性的进展，从以前不怎么清楚（最高分辨率约为 7 埃米），发展为现在原子级别的分辨率（3 埃米左右，例如本文中结构的分辨率为 3.6 埃米），就绕过了结晶这个瓶颈。清华花巨资购入（并维护）顶级电子显微镜，为本结构的解析提供可能。
第三，也是最重要的：研究者了解这个蛋白的特性。获得蛋白结构表面上看起来好像是一个通过高通量暴力筛选条件就能完成的工作，其实完全不是这样。研究者必须慢慢探索，摸透这个蛋白质的脾气，保证它的稳定，才能解出它的结构。
施组有先进的仪器、技术和经验，并对研究对象蛋白有深刻的理解，正所谓“天时、地利、人和”：
施子曰：“天时不如地利，地利不如人和”。
三埃晶体，七米电镜，环而解之而不得。夫环而解之，必有得天时者矣；然而不解者，是天时不如地利也。
剑桥非弱也，马普非穷也，学生非不聪敏也，千老非不多也；解而不精，是地利不如人和也。
故曰：纯化不以试样之多，结晶不以射线之猛，解结构不以算法之利。懂蛋白者多助，藐蛋白者寡助。寡助之至，lysozyme precipetates；多助之至，spliceosome behaves。以 spliceosome 之 behaviour，攻 lysozyme 之 precipetation；故结构有不解，解必成矣。
为什么讲这个工作极有可能获得诺贝尔奖？
以中心法则之重要，解释清楚中间的任何一个环节，都可能获得诺贝尔奖。阐明 spliceosome 的工作机理，搞清楚 mRNA 是怎样 splice 的，当然值得一个诺贝尔奖。
施一公并非 spliceosome 机理阐述的唯一贡献者，为何诺贝尔奖可能颁给他？
诺贝尔奖是颁给一个工作的最先发现者和突出贡献者，往往颁给多人而非一人。如 GPCR 的奖给了Robert Lefkowitz和Brian Kobilka两个人；ribosome 的奖给了Venkatraman Ramakrishnan、Thomas A. Steitz和Ada Yonath三个人，等等（Roger D. Kornberg这种以一己之力解结构、阐机理的变态大牛除外）。
Spliceosome 的这个奖，要给肯定也不是给施一公一个人。Reinhard Lührmann 和 Kiyoshi Nagai 的工作，至少有同样的分量。施一公虽然没有做很多 spliceosome 功能方面的研究（这也不是他的长项），但拿到了最完整的高清结构，这个工作也是非常重要的。
（@杨锐 对结构生物学领域诺贝奖的理解，更为深刻。可同时参看他的回答。）
Spliceosome 的工作什么时候能得诺贝尔奖？
排着吧。
前有 epigenetics，后有 CRISPR（这个要提一下：这个给奖也是给 Jennifer Doudna 和 Emmanuelle Charpentier 而不是 Feng Zhang，因为后者只是技术的发展者而非发现者、机理阐明者。这个和施一公的情况不一样），很多这个级别的工作还没给，大家都在排着队。11g 貌似身体不错，希望能等到 2333333。
